(一) 准备工作
1、在开始工作以前，要清除生物安全柜内表面的污染。
2、将所有必需的物品置于安全柜内，以尽可能减少双臂进出前面开口的次数。物品放置要注意以下几点：
①II级生物安全柜台面前面和后面的进气格栅不能被物品阻挡。
②所有物品应尽可能地放在工作台后部靠近工作台边缘的位置，并使其在操作中不会阻挡后部格栅。
③可产生气溶胶的设备(如：混匀器、离心机等)应靠近安全柜的后部放置。有生物危害性的废弃物袋、盛放废弃吸管的盘子等体积较大的物品，应该放在安全柜内的某一侧。
④洁净的物品应放置在距离产生气溶胶器皿至少15 cm外，降低交叉污染的可能性。
⑤容易受紫外线损伤的实验样本可以在紫外线杀菌后的实验之前放入。
⑥不要在工作区内排放过多的物品。
3、关闭操作前窗，打开生物安全柜的紫外灯，对生物安全柜工作台面，侧壁表面以及后壁内侧进行杀菌处理。
4、稍微打开操作前窗，让生物安全柜工作区排气几分钟之后再开始工作。

(二) 操作注意事项
1、在使用生物安全柜时应穿着个体防护服并戴手套防止被污染。在进行一级和二级生物安全水平的操作时，可穿着普通实验服。手套应套在实验服袖口外面。有些操作可能还需要戴口罩和护目镜。
2、在生物安全柜内，避免使用酒精灯等明火灭菌器。使用明火会对气流产生影响，并且在处理挥发性物品和易燃物品时，也易造成危险。在对接种环进行灭菌时，可以使用红外线电加热器,或者干脆使用一次性塑料接种环。
3、手和双臂伸入到生物安全柜中等待大约1min,以便安全柜调整完毕并且让里面的空气“扫过”手和双臂的表面以后，才可以开始对物品进行处理。
4、工作时，尽量减少手臂的移动，移动时要缓慢，防止干扰柜内气流。在移动双臂进出安全柜时，需要小心维持前面开口处气流的完整性，双臂应该与工作区开口垂直地缓慢进出前面的开口。
5、在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行，所有操作在工作台面的中后部进行。
6、工作时，耐高压灭菌的生物危害性废弃物袋以及吸管盛放盘放在安全柜内不能拿出安全柜，否则在使用这些物品时双臂就频繁进出安全柜，这样会干扰安全柜空气屏障的完整性，从而影响对人员和物品的防护。
7、一旦实验过程中产生溢洒物，用消毒纸巾置于其表面吸附清理。
8、尽量使安全柜处于持续工作状态，并对所有物品进行表面消毒处理，提供大程度的人员保护。从安全柜内部拿取可能产生污染的物品时，要进行表面消毒处理。

(三)使用完毕后的处理
1、系紧用过的生物废物袋。
2、对安全柜内壁、后壁、工作台面和前窗内侧进行清洁和消毒处理。
3、由于剩余的培养基可能会使微生物生长繁殖，因此在实验结束时，包括仪器设备在内的所有物品都应清除表面污染，并移出安全柜。
4、从安全柜内移出手臂之前，要进行表面消毒处理，然后垂直于工作区开口缓慢地移出。
6、在每次使用后，要清除生物安全柜内表面的污染。工作台面和内壁要用消毒剂进行擦拭，所用的消毒剂要能够杀死安全柜里的任何微生物。在每天实验结束时，应擦拭生物安全柜的工作台面、四周以及玻璃的内外侧等部位来清除表面的污染。在对目标生物体有效时，可以采用漂白剂溶液或70%酒精来消毒。在使用如漂白剂等腐蚀性消毒剂后，还用无菌水再次进行擦拭。
7、关闭前操作窗口并开启紫外灯。