Cancers 2022, 14, 154（下同）

       通常，ADC药物作用机制主要包括以下步骤：ADC药物中的抗体与细胞表面表达的抗原HER2结合，此后ADC-HER2形成的复合物通过受体介导的内吞或胞饮作用被内化，在成熟的溶酶体作用下ADC发生降解，释放的细胞毒性物质导致DNA损伤等作用，最终影响肿瘤细胞的增殖。

ADC药物作用机制图示

       然而，具体的药物在作用机制上也会基于药物的性质存在差异。以T-Dxd和T-DM1为例，首先两个药物在Linker的选择上存在差异，所以使用不可裂解的T-DM1切割只能发生在溶酶体区室，需要酸性蛋白酶（如组织蛋白酶B或纤溶酶）的作用，才能释放细胞毒DM1；而可裂解的T-Dxd则可发生在早期或晚期内体以及溶酶体中。其次，虽然两个药物都是作用于细胞周期，但T-DM1作用于靶细胞中的微管聚合属于微管蛋白抑制剂，而T-Dxd作用于拓扑异构酶 I 阻止DNA链的断裂和重新连接，最终导致细胞凋亡。第三，T-DM1不具备旁观者效应，而T-Dxd可以通过旁观者效应杀伤HER2低表达或不表达肿瘤细胞。
       不难看出，尽管HER2 ADC在作用机制上具有相似性和一致性，但也并未完全相同。表现在抗体种类、Linker和载荷上的差异形成了药品间的差异化策略，多数也会转化为临床疗效的不同。

       ADC的耐药机制：基于作用机制的追溯

       在理解了ADC药物的结构和作用机制之后，就不难推测可以发生的耐药种类：抗原HER2的改变、HER2内化的改变、溶酶体的改变、药物外排泵的表达和活性增加、增加配体的产生和替代通路的激活、信号通路蛋白变化等。

       1. HER2的改变

       仍以T-DM1为例，由于T-DM1中的抗体需要结合HER2蛋白，当患者接受了前线的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗治疗之后，可能会降低HER2的表达水平，同时T-DM1又不具备旁观者效应，导致降低了T-DM1 作为二线疗法的治疗效果。因此，作为应对需要对HER2阳性乳腺癌患者重新进行 HER2 状态检测，以保证疗效。
       对于在手术前经历了局部进展，也会显示出HER2表达的高度异质性。总的来说，就是要关注HER2表达状态，HER2缺失或表达下降都是T-DM1耐药的原因。推此即彼，与曲妥珠单抗结合的亚域IV改变或缺失以及与帕妥珠结合的亚域Ⅱ都会对使用这两种抗体制备的ADC药物产生抗性。此外，MUC4作为一种膜相关粘蛋白，其表达也与曲妥珠单抗耐药有关，通过部分掩蔽HER2并阻止其结合。

       2. HER2内化的改变

       当HER2 ADC 与 HER2 结合之后，该复合物就会内化到细胞中，内皮素A2蛋白可以促进这一过程。事实上，已经观察到这种蛋白在HER2阳性细胞中的沉默会降低HER2内化并减弱对曲妥珠单抗和T-DM1的反应。HER2泛素化和运输到溶酶体的过程可以通过与伴侣HSP90的组成性结合而改变。因而，改变HER2靶向治疗的功效。
       另一方面，含HER2的内体向质膜的快速再循环可能会减缓T-DM1到达溶酶体的速度。HER2的特点是快速循环，在曲妥珠单抗结合后观察到这一过程。在对T-DM1获得性耐药的临床前模型中，观察到 T-DM1-HER2 复合物的更快循环和DM1的细胞内释放减少。不过，该模型的 HER2 水平也低于亲本系，也会导致表现耐药表型。
       最近，描述了 T-DM1 通过由 CAV1 组成的小窝内化，这种情况限制其到达溶酶体的抗性机制。在临床前模型中，对 T-DM1 具有获得性抗性的细胞系中观察到 CAV1 的过表达。此外，T-DM1 和 CAV1 的共定位与一组 HER2阳性细胞中对 T-DM1 的反应降低相关。而且，CAV1 的沉默不足以恢复 T-DM1 敏感性。

       3. 溶酶体的改变

       HER2 ADC 到达溶酶体和溶酶体酶的处理对于释放与抗体结合的有效载荷至关重要。溶酶体是酸性区室，蛋白水解能力取决于调节溶酶体 pH 值的液泡质子泵 H+-ATP 酶（V-ATP 酶）。由于带电的分解代谢物（极性）不能自主渗透溶酶体膜，因此 Lys-MCC-DM1 需要借助从溶酶体到胞质的转运机制。SLC46A3 是一种溶酶体膜蛋白，可介导 Lys-MCC-DM1 从溶酶体向细胞质的转运，在T-DM1获得性抗性的几个模型中观察到 SLC46A3 表达缺失，其慢病毒表达恢复了对 T-DM1 的敏感性。此外，最近研究表明，溶酶体 pH 值的增加以及溶酶体酶活性的降低也是对 T-DM1 产生抗性的原因。
       另一种对 T-DM1 抗性的模型中，还报告了溶酶体酸化的降低。在这种情况下，观察到 Lys-MCC-DM1 的细胞内浓度降低，因为 V-ATP 酶在抗性细胞溶酶体中的异常活性降低了 T-DM1 的分解代谢和活性分解代谢物的产生。

       4. 药物外排泵的表达和活性增加

       外排泵的表达和/或活性增加是化疗耐药性的重要机制。这也不难理解，如果细胞中释放的有效载荷，过多的被外排泵转送至胞外，特别是对Lys-MCC-DM1这种无法自动渗透的药物（类似旁观者效应），有效性必然降低。
       具体而言，ABCB1/MDR1/P-gp、ABCC1/MRP1、ABCC2 和 ABCG2/BCRP/MXR/ABCP 的表达改变导致临床前模型中对 T-DM1 的耐药性。在这些研究中，转运蛋白活性的抑制恢复了对 T-DM1 的敏感性。

       5. 配体增加和激活替代通路

       其实，这种机制更多的是具有了替代信号通路，以及影响了药物疗效的发挥。在一项体外研究中，由于HER2/HER3 的二聚化和PI3K/AKT通路的激活，或者在一些 HER2阳性细胞系中添加 HER3 配体神经调节蛋白 (NRG) 抑制了T-DM1 的作用。
       此外，在对 T-DM1 获得性耐药和对曲妥珠单抗原发性耐药的模型中，HER2 水平的降低伴随着EGFR 水平的升高，也是一种耐药机制。然而，EGFR 沉默不足以逆转耐药表型。并且，观察到增加的 EGFR 水平导致整联蛋白（α5β1 和 αVβ3）的量增加，从而导致抗性细胞的运动性和侵袭性增强。

       6. 参与信号通路的蛋白质的变化

       这种耐药机制比较复杂，而且针对不同的载荷也会表现出不同的机制。不过，这种耐药机制又相似或接近直接使用载荷导致的信号通路上的改变。
       针对T-DM1而言，处理后会导致细胞周期蛋白 B1 增加并停滞在细胞周期的 G2/M期，这一过程会触发有丝分裂灾难表型特征。然而，在T-DM1 具有抗性的细胞中没有观察到这种现象，没有发生细胞周期蛋白 B1 的积累。
       此外，也发现在对 T-DM1 具有抗性的模型中有丝分裂激酶、polo 样激酶 1 (PLK1) 的表达增加。而且，PTEN 水平降低也会导致抗性表型，降低了 T-DM1 和曲妥珠单抗的作用。同时，PTEN 的缺失和编码PI3K催化亚基 (PIK3CA) 的基因激活突变又会导致 PI3K/AKT 通路的组成性激活，也成为HER2受体治疗的耐药性机制。
       最近，在对 T-DM1 获得性耐药的 HER2 阳性乳腺癌细胞系中观察到抗微管蛋白药物的耐药性增加。这些细胞的聚合微管蛋白和βIII微管蛋白水平较低，基线非整倍性增加。然而，亲本系中微管蛋白βIII的沉默不足以产生对T-DM1的抗性，表明耐药性的原因可能涉及多种因素，包括微管/微管蛋白复合物的修饰和染色体不稳定性。

       如何管理ADC的耐药问题

       如何管理ADC药物的耐药问题，自然也要从耐药机制出发，清晰每一种药物或表现出的耐药模式选择合适的应对策略。
       比如针对药物外排泵，有效的策略就是替换一种外排泵不能主动泵出的药物形式，包括替换为不同载荷、不同偶联技术的新型ADC药物或载荷的修饰物，如基于马来酰亚胺的亲水接头PEG4Mal替换的DM1，使其变成了Lys-PEG4Mal-DM1，避免了被排出。当然，也可以选择降低药物外排泵活力的药物，减少活性代谢物外排。
       面对HER2的改变，包括内化、循环和二聚体，也可以采取相应的措施。对于HER2再循环可以加入抑制循环加速的HSP90 抑制剂，不仅可减少 HER2 再循环还可以诱导 HER2 在细胞内囊泡中的定位，从而改善HER2的降解。对于二聚体，可以采用HER3抗体或HER2/HER3双特异性抗体，当然目前国内还没有这些药物上市。
       面对通路激活的耐药情况，相对而言已经有更多的经验和药物，比如联合使用小分子HER2抑制剂或PI3K/AKT和MAPK/ERK通路的抑制剂。联合用药不仅是一种对抗耐药性的有效策略，也可以是一种增效的治疗手段，传统化疗中就有很多组合疗法。而对于ADC药物，同样可以联合小分子药物、PD-1/L1免疫药物等。

       写在最后：ADC代表了一类具有高抗肿瘤活性的药物，但国内的应用尚没有完全普及，耐药性的种类和应对经验还需要积累。总的来说，针对HER2 ADC药物的耐药机制多样，需要结合抗体、溶酶体、载荷等多方面的因素共同分析。目前，没有更多的针对 T-DXd或其他HER2 ADC药物耐药机制的描述，但预计针对曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和/或T-DM1描述的一些机制可以外推至T-DXd及其他使用相同抗体或技术的HER2 ADC药物。

参考文献
1、Cancers 2022, 14, 154. https://doi.org/10.3390/cancers14010154.